• (一)植物病害发生原因的认识
• 1.古老的神权统治时期：把自然灾害归因于神的惩罚，但实践中也有一些防病的经验。
• 2.自生论：相信一切生物都是无中生有，染病是植物自发产生霉菌。
• 3.唯病原论：17世纪显微镜问世，人们在显微镜下见到了细菌、真菌、线虫及原生动物，并证明一些常见病害是病原物侵染的结果。
， 1845年-爱尔兰-马铃薯晚疫病-饥饿和逃荒的饥民近200万人；H.A.Debary（Phytophthora infestens）建立了病原学说（germ theory）。
• 4.病原多因论： 随着人们对于病害发生原因中主客观环境因素作用的认识的日益深化，病害多因论逐渐取代了病原单因学说，60年代以后生态学日益广泛的渗透，人们提出了病害管理.
2.近代植物病理学：19世纪中叶后形成和发展起来的。
3.世界主要植物病理学学术团体
（1） 国际植物病理学会(ISPP) （2）美国植物病理学会(American Phytopathological Society)：《Phytopathology》,《Plant Disease》,《Molecular Plant-Microbe Interaction》。加拿大植物病理学会/不列颠植物病理学会/日本植物病理学会/印度植物病理学会
2.世界植物病理学的相关研究机构（research institution of plant pathology in the world）
洛桑试验站（Rothamsted Experimental Station）:1843年英国人建立。
C.A.B.国际真菌研究所(International Mycological Institute)
美国贝尔兹维尔农业研究中心
美国标准菌种保藏所
3.中国植物病理学学术团体
（1）中国植物病理学会《植物病理学报》（2）中国植物保护学会 《植物保护学报》，《植物保护》（3）中国微生物学会 《微生物学报》，《生物工程学报》，《病毒学报》，《微生物通报》等。（4）中国菌物学会： 《菌物系统》（真菌学报）
4.中国植物病理学的相关研究机构
（1）农业系统所属植物病理研究机构 农业部植物检疫实验所 中国农业院植保研究所 中国农业院生防研究所 中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心 各类作物专业研究所 省（市、自治区）植物病理学研究机构
(2)中国科学院所属有关植病研究机构
中国科学院微生物所：病毒、真菌研究室等。
(3)高等院校所属植物病理学研究机构
高等农业院校,综合性大学。
5.植病研究法的实验技术 常用培养基的制备和灭菌。病原物（或拮抗微生物）的分离培养、菌种纯化和单孢分离。病原物（或拮抗微生物）的培养、菌体收集和生长量的测定。
病害的人工接种、病程观察和病害调查。病原真菌的显微测微和孢子萌发。
6.普通显微镜的保养
1、观察完后，移去观察的载玻片标本。
2、用过油浸镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着擦镜液擦拭2—3次，最后再用擦镜纸将二擦镜液苯擦去。
3、转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。
4、将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套。
7.培养箱 智能隔水恒温培养箱、隔水培养箱、电热培养箱、生化培养箱
培养箱的配置和使用
配置：22（℃）、30（℃）、37（℃）培养箱各一个
使用注意事项：
(1)箱内不能放入过热或过冷的物品，取放物品时应快速进行并做到随手关闭箱门。
(2)内放一杯水，以保持湿度。
(3)培养物不能放在最底层，也不得放置过于拥挤。
(4)每月消毒一次，先用3%的来苏尔液涂布消毒，再用清水擦净。
(5)不得当烘箱使用。
8.超净工作台
三大类 型：侧流式、直流式和外流式
超净台的使用和注意事项
1、使用前先打开紫外灯照射，紫外线照射时间40-60分钟；
2、使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布擦拭；
3、请保持超净台整洁，不要堆积杂物；
4、使用完毕，勿忘关闭通风开关和酒精灯；
5、请做好使用记录。
6、如遇故障，除记录在册外，还应及时与有关人员联系，尽早排除故障。
7、学期开始做无菌试验一次，以保证净化台正常使用。平时可根据情况，定期做无菌试验，以测定净化台是否符合无菌要求。
9. 离心机
离心机的类型：普通离心机、高速离心机、超速离心机
10. 灭菌器：干热灭菌器、湿热灭菌器
1、电烘箱（干燥箱）
用途：用于玻璃器皿等耐热物品的烤干和灭菌。玻璃器皿等物的灭菌，温度160~165℃，灭菌 2小时。
玻璃器材的干热灭菌方法
(1)将培养皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后，用报纸包好，或装入特制的铁筒中。
(2)将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中，彼此间留有一定的空隙以便流通空气。
(3)关紧箱门，打开排气孔接上电源。
(4)待箱内空气排出到一定程度时，关闭上排气孔，继续加热至一定温度后，调节温度控制旋钮固定温度，在160℃—165℃保持2小时即可。
(5)待自然降温冷却后(60℃以下)才能开门取出玻璃器皿。
2、高压灭菌锅
用途：培养基、生理盐水、废弃物、采样器、纱布、衣物的灭菌。
种类：手提式、立式、卧式杀菌锅
第一章 植物病害文献
文献来源：
（1）摘要及索引
1922年创刊：Review of Applied Mycology,简称R.A.M.（应用真菌学文献摘要），1970年改名为，Review of Plant Pathology,简称R.P.P.（植物病理文献摘要）
1962年创刊: Annual Review of Phytopathology(植物病理学评述)
BA(Abstract of Biology), CA (Abstract of Chemistry)
中国农业文摘
全国报刊索引, 中文期刊目录等。
（2）期刊
1911年创刊Phytopathology，美国
1917创刊 Plant Disease
1988创刊 Molecular Plant-Microbe Interaction,简称 MPMI
Annals of Applied Biology,1914，英国
Physiology Plant Patholoty 1971
Plant Pathology, 1952
Annals de Phytopathlogie,1969，法国
植物病理学报和植物保护学报,(中国植物病理学会和中国植物保护学会出版)。
微生物学报,菌物学报 (真菌学报),病毒学报,中国生物防治等
（2） 综合期刊 Science Nature 中国科学 中国农业科学。
3. 文献的记载（参考文献写作格式)
（1）期刊
[序号] 作者．文献题名［文献类型标］．期刊名称，年，卷（期）：起止页码.
（2）书籍
[序号] 作者．书名［文献类型标识］．版次．出版地：出版单位，出版年，起止页码.
（3）论文集
[序号] 作者．题名［文献类型标识］．主编．论 文集名．出版地：出版者，出版年，起止页码.
（4）学位论文
[序号] 作者．题名［文献类型标识］．保存地点：保存单位，年份.
（5）报纸文章
[序号] 作者文献题名［文献类型标识］报纸名，出版日期(版次).
（6）国际、国家标准
[序号] 标准编号，标准名称［文献类型标识］.
※ 文献类型标识
专著 M,论文集 C,报纸文章 N，期刊文章 J，学位论文 D
报告 R,标准 S,专利 P,专著及论文集析出文献 A,其他 Z
三、现代的文献检索方法
（1）CNKI 中国知网（China national knowledge infrastructure）
www.cnki.net--可下载全文
（2）《万方数据资源系统》
（3）NSTL 国家科技图书文献中心（National science and technology library)
www.nstl.gov.cn，----免费题录，中文摘要
(4) 国家农业数字化图书馆
www.caas.net. cn
第二章 培养基
培养基: 人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养物质。
一、配制培养基的基本原则
1、适合不同微生物的营养特点。
2、调配好培养基中各种营养成分的比例和浓度。
(1) 浓度适中原则
(2) 营养比例原则
a. C/N
b. 其它营养的比例（矿质元素、氨基酸）
(3) 培养基的pH值的控制。
二、培养基的类型
1、按照培养基成分
a. 合成培养基:化学成分和浓度完全清楚的物质配制的培养基(高氏一号合成培养基)
b. 天然培养基：以动植物组织或微生物浸出液为原料配制的培养基。如：牛肉膏蛋白胨
2、按照培养用途：
a. 基本培养基： 将多种微生物都需要的营养物质配而成培养基。
b. 富集培养基(增殖培养基）： 为分离某种微生物配制出的适合它生长而不利于其他微生物生长的培养基。
c. 鉴别培养基： 根据微生物的代谢特点，通过指示剂的呈色反应，用以鉴别不同微生物的培养基。（伊红-甲基蓝培养基鉴别大肠杆菌(菌落小,绿色光泽)和产气肠杆菌(菌落大,灰棕色)）
3、按照培养基的物理性状
a. 固体培养基： 在液体培养基中加入凝固剂使呈固体状态，称为固体培养基。(琼脂1.5-2%)
b. 液体培养基：未加凝固剂呈液态的培养基称为液体培养基。
c. 半固体培养基：在液体培养基中加入少量琼脂（0.2-0.5%） 。
三、植物病理学常用培养基的配制：
不同病菌不同目的选用不同的培养基（成分、理化性质等）。
1.马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：真菌分离培养，也可细菌。
2.肉汁胨培养基：成分为牛肉浸膏，蛋白胨，用于细菌的分离和培养。
常用培养基配方
1.PDA培养基：
马铃薯： 200克
葡萄糖： 20克
琼脂： 20克
水： 1000毫升
2.肉汁胨培养基
牛肉浸膏：3克
蛋白胨： 10克
琼脂： 20克
水： 1000毫升
四、灭菌对培养基的影响
1.酸度的变化：酸度提高（pH值降低）
2.碳水化合物的水解：多糖易水解。
3.葡萄糖发生的反应：与氨基酸反应或焦化。
4.沉淀物的产生：
第三章 灭 菌
§灭菌指利用物理和化学的方法杀灭或除去物料及设备中一切生命物质的过程。
§消毒是指用物理或化学的方法杀死物料、容器、器具内外的不需要的微生物，一般只能杀死营养细胞而不能杀死芽孢。
一、 灭菌的原理和方法
1. 热力灭菌
使蛋白质变性酶失活，同样温度下湿热灭菌效果好
（1）干热灭菌：火焰灭菌法、干燥加热空气灭菌
（2）湿热灭菌：加压蒸汽灭菌---压力与温度的关系p55，高压锅用法和注意事项p56。
常压流动蒸汽灭菌---蒸汽不超过100℃，巴斯德灭菌法75℃，30分钟或80℃，15分钟（…..）。间歇灭菌（….）。
注意事项： 温度、压力和时间
手提式高压蒸汽灭菌锅的使用：
1.加水：将盖打开并把内筒拿出，检查水位，并补水。
2.装入待灭菌的物品：将内筒放入灭菌锅，然后将需要灭菌的物品装入内筒，不要太紧太满，盖好盖子，然后对称旋紧两边的螺旋。
3.加热和排气：接通电源，打开排气阀，使锅内的冷空气全部排出，到0.025MPa时排冷气。
4.升压保压力：0.1MPa时，维持20min
5.降压与排气：自然冷却（注意）
6.出锅：
2. 过滤灭菌
利用比微生物更小孔径的过滤介质，待滤液或空气通过时将细菌类微生物截留，而达到除菌的目的）。气体过滤、液体过滤。
3. 辐射灭菌(电磁波、射线灭菌法)
以紫外线最常用。但细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线的抵抗力强。
紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和无菌室、培养间等空间的灭菌，且距照射物不超过1.2 m；对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液体物料的灭菌。
紫外线灭菌法： 一般30 W灯管，9 m3空间，距地面2 m每次打开紫外线照射0.5 h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。
利用人工制造的能辐射254nm波长紫外线专用灯（阻碍DNA的复制，空气在紫外线辐射下被氧化生成的H2O2和H2O2•O3也有杀菌作用）
（1）电离辐射：x-射线、γ-射线，主要用于药物和食品。
（2）紫外线辐射（20~30分钟）：能量和穿透力都很低，几乎不能穿透固体，对液体的穿透力也很差。
4.化学灭菌：
某些化学药剂能与微生物发生反应而具有杀菌的作用。微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂。
化学药剂适于生产车间环境的灭菌，接种操作前小型器具的灭菌等。
化学药品的灭菌使用方法，根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。
二、 各种材料的灭菌处理
1. 玻璃器皿的灭菌：
（1）干燥热空气灭菌法---主要方式
要求：将空气加热到165-170℃处理1小时，或150℃处理2小时，注意不可超过180℃；利用电烘箱进行。
注意：器皿要干燥；适用于各种培养皿、吸管、玻棒等干燥耐热物品 。
(a) 将培养皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后，用旧报纸包好，或装入特制的铁筒中(每个吸管用纸包好后装入铁筒)，包纸时应将吸取的一端放在取时先拆开的一端，以便取用时手勿触及要求灭菌的一端。
(b)将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中，彼此间留有一定的空隙以便流通空气。
(c)关紧箱门，打开排气孔接上电源。
(d)待箱内空气排出到一定程度时，闭上排气孔，继续加热至一定温度后，固定温度，灭菌温度一般165℃～175℃保持1小时即可。
(f)待自然降温冷却后(60℃以下)才能开门取出玻璃器皿，避免由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。
（2）也可高压蒸汽灭菌（121℃，20分钟）
（3）临时需要可70%酒精或0.1%升汞，然后灭菌水冲洗。
2. 培养基的灭菌：
（1）高压蒸汽灭菌：121℃，20分钟，量大或不同培养基可延长灭菌时间。
（2）也可过滤灭菌：
液体滤菌器
适用于一些不耐热的液体材料和除去空气中的细菌和真菌等微生物。
三、实验室和接种室的灭菌
（1）紫外线灭菌辐射（紫外线）进行，30min。
紫外线照射物体不能超过1.2m为宜，穿透能力差，只适用与空气及物体表面灭菌。
紫外线对人体有伤害作用，可严重灼烧眼结膜、伤害视神经，对皮肤也有刺激作用。
（3） 化学（高锰酸钾加甲醛）
第四章 病原物的分离培养
一、病原物的分离
1.植物病原真菌的分离
（1）分离准备
（a）应该在洁净的条件下进行
（b）所需物品：灭菌培养皿、培养基、小烧杯、酒精灯、70%、95%酒精、0.1%升汞等。
（2）材料的选择
症状典型新近发病的植株、器官或组织（少腐生菌污染），如果所采材料已经污染，可先接种后分离。
分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响，因为在感病植物受害部位的内外，要有多种腐生菌，为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。
（3）组织的表面消毒
（a）0.1%升汞溶液特点：渗透力强，时间短，需水冲洗。
（b）漂白粉（有效成分为次氯酸钙）：特点：随配随用，消毒种子有时可不冲洗。
（c）3-5%次氯酸钙溶液：漂白粉成分不固定而影响消毒结果，
（d）酒精和其他：70%酒精，火烧。
升汞；漂白粉；次氯酸钠；酒精
（4）一般分离方法
（a）组织分离法:选材-组织表面消毒-灭菌水冲洗-培养
（b）稀释分离法:选材-孢子悬浮液-稀释-培养
（c）细菌污染排除法:培养基中加入青霉素等抗生素，或乳酸等
2.植物病原细菌的分离
（1）分离方法
（a）稀释分离法：组织表面消毒--培养皿1中研碎（灭菌水0.5毫升，静置10-15分钟）---培养皿2（水，1环菌）---培养皿3（水，1环菌）----分别倒入培养基（45度左右）--培养。
（b）平板划线分离法：表面消毒---研碎于水中--培养基上划线。
二、菌种的纯化和单孢分离
（一） 微生物纯培养的概念
纯培养物：实验室条件下，由一个微生物细胞或一种细胞群繁殖得到的后代。
（二）微生物纯培养技术
纯培养基本步骤： （1）分离，（2）培养
纯培养方法：稀释平皿法、划线法、单细胞挑取法
稀释平板分离法使用过程中的几个问题
1) 梯度稀释度的确定：需分离微生物在样品中的数量
2) 选择菌落接种的依据： a、菌落特征； b、菌体的特征
3) 微生物纯培养的标准： 菌落特征一致性
4) 操作要点：无菌操作
2、单细胞挑取法：从待分离材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养的过程。
3、平皿划线法 用接种环沾少许待分离的材料，在培养基表面进行多次平行划线，使微生物细胞分开生长以获得微生物纯培养的过程。
三、病原物的培养和生长量的测定
（一）培养性状的观察
（1）真菌：菌落质地，菌落正反面的颜色，生长率快慢，有无特殊气味等。
（2）细菌：液体培养基-生长量、有无沉淀、色素产生等，菌膜、菌环以及它们的厚度，细菌是否形成团状的漂浮物等；斜面的培养性状-菌苔的形状、颜色、粘度，生长量等。
（二）植物病原物生长量的测定:
1. 微生物数量的测定（1）显微镜直接计数法：使用细菌计数板或血球计数板在显微镜下直接计数。 优点：操作简便，计数直观。
测数计计数法：适用于真菌孢子和细菌的计数。
（ 2）稀释平板计数法 对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。 优点：传统计数方法。对设备要求不高。
平板菌落计数法：将细菌悬浮液系列稀释后，取一定量不同稀释度的细菌悬浮液，从形成菌落的数目和稀释度，可算出每毫升中细菌数。
平板上菌落数x稀释倍数
每毫升中细菌数= ————————————
平板上加菌液的量（ml）
（３）比浊计数法 根据细菌悬浮液的吸光度测定其数量。优点：简便，直接。
2. 微生物重量的测定
（1）称重法 用离心或过滤的方法将菌体从培养基中分离、冼净，称湿重或干重。优 点：简单可靠。
湿重测定：测定真菌或单细胞生物的生长，在振荡或通气搅拌的液体培养基中培养，纱布或滤纸过滤真菌，离心收集单细胞生物。
干重测定：同上。但需要干燥菌体
（ 2）含氮量测定法 根据样品中菌体蛋白质含量计算微生物重量的方法。原理：（a）微生物蛋白质含量稳定（b）氮是蛋白质的稳定成分 (蛋白质量=6.25×总含N量) 优点：测定准确
3.其他测定方法
（1）直线生长：测定真菌的直线生长。平板培养真菌菌落直径、半径或面积随时间的变化；特制玻璃培养管。优点：可连续测量，缺点：不能显示出菌丝体生长的厚薄以及菌丝体内物质积累量的多少。（2）比例计数法，是以数目已经测定的酵母菌悬浮液与待测的细菌悬浮液混合，取1滴涂在载玻片上，固定后染色，从它们的比例来计算待测的悬浮液中细菌数。
四、菌种保存
1.真菌（1）室温保存：
清洁的环境，16~17℃，相对湿度60%。每隔3~6个月需要移植1次。缺点：工作量大，易发生差错和污染，菌种退化。（2）低温保存：最常用的方法 4 ~8℃冰箱中，可降低真菌生长率，培养基也不容易干燥，真菌存活时间较长。每隔6~8个月需要移植1次。近年来受到重视的是超低温保存法（3）矿物油下保存：保存在矿质油下的真菌，生长虽然没有停止，但显著受到抑制，而且培养基不会干燥。菌种可存活10年，不需要反复移植。
（4）土壤中保存：
一般用于产生孢子的真菌
方法一：将孢子悬浮液加在试管中灭菌的土壤中，任其干燥后保存。或将干的真菌孢子与试管中灭菌的干土壤混合后保存。
方法二：试管中放5g土壤含水量70%的土壤，灭菌后将孢子悬浮液接种上，培养10d后保存。（5）干燥保存：真菌的菌丝和孢子用适当的方法干燥，可长期存活。
（6）冷冻干燥保存：使微生物快速冷冻。（7）灭菌水中保存将带菌琼脂培养基一起加入灭菌水中。
2.植物病原细菌的保存P188
（a）在植物组织中保存：叶斑病标本中的细菌可以保存在干燥的叶片上，最简便的方法是用吸水纸吸干保存，至于根、茎组织，可以放在塑料袋内，在-20℃下保存。
（b）斜面保存：不是很好的方法，多数细菌在斜面上不断生长和移植后，致病力容易发生变化。（c）灭菌水保存：洗下菌体--离心--于灭菌水中---室温或低温保存；也可挑下菌体直接放入灭菌水中。（d）矿物油下保存（e）甘油保存（f）冷冻干燥保存（g）干燥保存（h）明胶膜干燥保存
五、真菌孢子的产生、萌发和计数
真菌的鉴定主要是根据子实体和孢子形态、孢子萌发方式方面的性状
研究真菌的生活史、病害的侵染循环、病害的发生和流行条件等，都涉及孢子的产生和萌发问题。1.真菌孢子产生的条件
真菌产生孢子是由它的遣传特性所决定的，但受环境条件的影响很大，要在一定条件下才能产生孢子，一般来说，产生孢子的条件要比生长的条件严格，产生有性孢子的条件要比生产无性孢子的条件严格。
2.促使孢子产生的途径
（1）培养基的种类和成分：
（#）减低养分的浓度: （#）改变碳源、氮源和它们的比例（#）选用不同的培养基，试用不同的培养基，尤其是植物培养基，往往得到很好的结果，如：①燕麦琼脂培养基可以促进许多真菌产生孢子。②草木樨茎杆促镰刀菌产孢。③石竹叶促镰刀菌产孢。④胡萝卜块于水琼胶中，可以促使腐霉菌产生卵孢子。（#）微量元素和维生素等，许多真菌需要维生素，其中维生素B1最突出，锌和铜促进黑曲霉孢子形成等..。
（2）培养基的理化性质：
固体和液体培养基：许多真菌在固体、半固体培养基上比在液体培养基上容易产生孢子，这可能与培养基通气和蒸发有关。氢离子浓度：改变培养基的pH值能影响孢子的产生。在一定限度内，增加酸度，可以促使某些真菌产生孢子。灭菌方法：热力灭菌改变了培养基的成份，改用过滤灭菌和化学灭菌的方法，有时可以促使真菌生产孢子。（3）培养条件：
（#）温度：在高温或低温、或高温低温交替培养，有时可促进孢子的产生，
（#）光照：各种真菌对光的反应不同，许多真菌要有一定的光照才能产生孢子，也有少数真菌光照反而抑制孢子的产生。
（4）培养方法：
（#）通气和振荡：许多真菌接种在适当的培养液中，用通气、搅拌和振荡培养的方法，可以促进生长和孢子产生。如小麦赤霉菌振荡培养，可以得到大量的分生孢子。
（#）移植方法：有时挑取孢子比用菌丝体有利于孢子形成。
（#）划碎菌落：是菌丝体受伤，有利于孢子形成。
（#）长期培养：菌在同一种培养基上长时期培养，使菌种逐渐干燥，也能促使某些真菌产生孢子。
3.孢子萌发的条件
真菌孢子的萌发，受内在因子和环境条件的影响，同高等植物的种子。
内在因子：孢子的成熟度、寿命长短、休眠期长短等。
环境条件：温度、湿度、空气、养分和其他刺激萌发的物质、光照、氢离子浓度等。
4.孢子萌发的方法（1）悬滴法（2）载玻片上的萌发法（3）培养皿中萌发法（4）琼胶平板表面萌发法
5.孢子萌发的记载
目前比较一致的意见是：当芽管的长度超过孢子直径长度（不是正圆形的孢子，是指直径小的一边）的一半就作为已经萌发的孢子。观察若干视野平均后，求出孢子萌发的百分率：
萌发率=（已萌发孢子数/视野内孢子总数）×100%。
6.真菌孢子的计数 计数器计数法、培养皿计数法、浑浊度计数法。
第五章 植物病害的调查和植物病害标本
一、植物病害调查
植物病害调查内容主要包括：植物病害的分布和为害、发生时期和症状的变化，以及栽培和环境条件对植物病害发生的影响，品种在生产中的表现，防治效果等内容，通过病害调查掌握病害的发生和流行规律，为科研和生产实践提供依据和技术服务。
1.调查的类别
（1）一般调查： 当一个地区有关植物病害的资料很少，可进行一般调查，一般调查面要广，并且要有代表性。调查的病害很多，对发病率的计算并不要求十分精确。主要是了解病害的分布和发病程度。为了节省人力和物力，调查次数可少一些，最好在发病盛期进行，一般1-2次。（2）重点调查：经过一般调查发现的重要病害，可作为重点调查的对象，深入了解它的分布、发病率、损失、环境影响和防治效果等。调查次数要多一些，发病率的计算也要求比较准确，是对病害全面的了解。（3）调查研究：重点调查是对病害的各个方面进行全面的调查，而调查研究是针对其中的某一个问题进行深入的研究。例如：棉花黄萎病（病菌致病性，毒素、病害防治、）
2.发病程度（1）.记载方法（a）直接记数法b）分级记数法(严重度)（c）病情指数 发病率---发病植物或植物器官（叶片、根、茎、果实、种子）占调查植株总数或器官总数的百分率，用以表示发病的普遍程度。严重度---植物或植物器官的发病面积的大小，可用分级法表示。
病情指数---是全面考虑发病率和严重度两者的综合指标，当严重度用百分率表示时，则用以下公式计算： 病情指数= 普遍率× 严重度
三、标本的制作(p20)
1. 标本的干燥制作法： 简单而经济，可长期保存，应用最广。（1）茎和叶标本（2）幼嫩多汁的标本，如花和小苗。（3）肉质蕈类
2.浸渍标本制作法：浸渍标本占的面积大，保存时间有限，所以很少用于保存大量的标本。多用于保存教学和示范用的标本。3. 真菌菌种干燥保存法
四、标本的整理、排列和保藏1.盒装标本：2.蜡叶标本：3. 瓶装标本：4.塑封标本：
第六章 植物病原物的观察和切片制备
细菌：菌涌现象镜下观察、染色观察（单染、革兰氏染色等）；
病毒：内含体观察；
真菌：制片观察方法很多，有：挑取菌丝体或子实体检视；刮取菌丝体或子实体检视；撕下寄主表皮连同病原观察；切片观察等。
1.真菌：
（1）菌丝体和子实体的挑取检视
水；乳酚油；甘油乳酸液；水合氯醛碘液；甘油；甘油明胶等。
（2）叶面真菌的粘贴检视
透明胶带；醋酸纤维素；火棉胶和其他粘贴剂
（3）组织整体透明检视
水合氯醛透明：将小块病叶在等量的酒精（95%）和冰醋酸混合液中固定24小时，然后浸在饱和的水合氯醛溶液中，待组织透明后再取出用水洗净，经稀苯胺蓝的水溶液染色，用甘油作浮载剂检视。
水合氯醛透明可以检查枯叶表面和内部的病菌，观察叶片内的菌丝体和病原菌的吸器效果也很好。
透明所需时间因标本和观察对象而异。
乳酸透明：病组织在75%乳酸中浸几天后，寄主透明组织中有颜色的菌丝体和子实体可以看到，病菌如果是无色的，可用加0.5-1.0%苯胺兰的乳酸油染色后检视。
除以上两种透明方法外，还有乳酚油水合氯醛透明、水合氯醛苯酚透明、吡啶透明等方法。
（4）真菌的玻片培养检视
在琼胶培养基上培养的真菌，直接挑取检视往往会破坏真菌的结构，尤其是半知菌的分生孢子梗和分生孢子的排列。
（5）琼胶培养基中真菌的检视
琼脂培养基表面下的真菌结构，可以从平板上切取小块带菌的培养基观察。
（6）组织浸离检视
将植物组织用药处理，除去中胶层，使细胞分离。
（7）徒手切片检视
对于生长在组织内的复杂的产孢结构可进行切片。
2.细菌的形态观察：（1） 细菌运动观察（2）细菌大小和形状（3）革兰氏染色法（4）鞭毛染色（5）荚膜染色（6）芽孢染色等特征
二、显微测量和显微描绘
利用接目测微尺和镜台测微尺测量
接目测微尺：是一有刻度的圆玻璃，上边每一格所代表的距离因显微镜放大倍数、镜筒的长短而不同，所以要用镜台测微尺准定后才能用来计测。
镜台测微尺：是一玻片，中间有一圆圈，圈中央刻有一尺，长度是一毫米。分为十大格或一百小格，故每小格为0.01毫米或10微米。
当用目镜测微尺来测量细胞的大小时，必须先用镜台测微尺核实目镜测微尺每一格所代表的实际长度
目镜尺每格所代表的实际长度=（两重合线间镜台测微尺的格数/两重合线间目镜测微尺的格数）×10μm
第七章 植物病原物的接种和病程观察
接种试验的目的和意义：接种试验是植物病害研究的重要的工作，早期的接种试验主要是确定一种病原物的致病性，证明它是一种病害的病原物（Robert Koch于1884年提出柯赫法则就是以人工接种试验为基础的），以后逐渐扩展到各个领域如侵染过程、病害循环、病原物致病性分化、植物对病原物的抗性、病害流行、损失估计和病害控制的研究的各个方面
1.种子传染病害的接种
（1）拌种法：用病菌的孢子与种子搅拌后播种，这是黑粉病最常用的接种方法。如小麦腥黑穗病、杆黑粉病、大麦坚黑穗病。
（2）浸种法：即用孢子悬液浸种（如棉花炭疽病），浸种时再加以抽气，则孢子渗入种子较深，可以提高接种率。在人工培养基上不易产生孢子的真菌，则可以用搅碎的菌丝悬浮液浸种。
(3)花期接种：适用于在开花期侵入寄主的病原菌，如小麦的散黑穗病，可将孢子喷撒或注射于花器中。
2. 土壤传染病害的接种
（1）土壤接种法：将病菌在播种前或播种时拌在土中。（2）蘸根接种法：将幼苗的根部稍加损伤，在孢子或菌丝体悬液中浸过以后移植。
（3）根部切伤接种法：首先切伤根部，然后灌注病菌于根部附近。
3.气流和雨水传播病害的接种
（1）喷雾法：将孢子（或菌丝）悬液喷洒在寄主表面，使病菌可以从寄主的气孔、伤口或表面侵入。
①对于从气孔侵入的病菌，应注意喷洒叶背，叶背气孔的数目一般比叶正面的多。
②对于伤口侵入的病菌，喷洒前应先将寄主表皮稍微损伤，如用细砂土或金则砂磨擦叶面。
③叶面有蜡质层的水滴不易附在上面，接种前可用湿布将蜡质层擦去，或者喷洒的孢子悬浮液中加入适当的展布剂（如加0.1%的肥皂）液等。
（2）喷撒法：将干的病菌孢子喷撒在潮湿的植物表面上。如白粉菌和锈菌的孢子可与滑石粉混合后放在喷粉器中喷撒。加滑石粉的量是孢子量的10倍左右。（即孢子：滑石粉=1:10）
（3）涂抹法：如接种麦类锈菌，由于寄主表面和锈菌孢子都不易沾湿（不宜用喷洒法接种），可先用手指沾水磨擦叶片，使表面有一薄层水膜，然后将孢子涂抹在上面。（4）注射法
5）针刺法
4. 昆虫及其他生物介体传播的病害：蚜虫、叶蝉和飞虱等；饲养无毒虫---饲毒----传毒---杀灭昆虫……….。
5.机械传染的病害：病毒从植物表面的机械损伤侵入，又叫汁液传染。
（1）汁液摩擦接种：最常用病毒的方法，步骤如下：
（a）病叶组织在研钵中研碎，加水2-10倍，用纱布过滤并挤出汁液，（研磨时可加一定的缓冲液）。
（b）将少量细金刚砂（400-600目）加在汁液中或撒在接种的叶面上，作为磨料，造成微伤口。
（c）用手指、纱布、玻璃刮勺、毛笔或小扁刷等蘸取汁液在叶片上来回轻轻磨擦。
（d）用清水将叶面多余的汁液和磨料轻轻洗去，该法适于植物苗期接种或在新展开的嫩叶上接种6.嫁接和菟丝子传染病害：
系统性感染的病毒病，都可以嫁接传染。
嫁接传染是人为的（如嫁接繁殖），很少自然发生。
三、影响接种实验的因素
1.病原物的致病性（不同生理小种，菌株）
2. 寄主植物的抗感性：（不同品种、不同生育期）
3.环境条件
（1）湿度：（一般需要保湿12-24小时，病毒除外）
（2）温度：（不同病害有不同的要求、如霜霉病等）
（3）光照：（有些病害需要光照要求）
第八章 各类病原物的分类研究
一、植物病原真菌(菌物)
二、植物病原原核生物
三、植物病毒
四、植物线虫
五、植物寄生性种子植物1.分类依据：
形态学（以有性生殖阶段的形态特征为主）细胞学 生理学 生态学
3．分类等级与命名：
和的有的植物一样，真菌的分类也是按如下等级依次排列的：界、门、纲、目、科、属、种。
必要时还可分亚门、亚纲、亚目、亚科等等级。种是真菌分类的基本单位，许多种归为属。
书写各分类等级的学名时，都有标准化的字尾
门——Mycota
纲——Mycetes
目——ales
科——aceae
属和种的名称没有标准字尾。一种真菌只能有一个学名， 采用林奈的拉丁文“双名法”。
一个学名包括3部分：属名+种名+定名人
属名：拉丁文斜体，且字首大写；
种名：拉丁文斜体，一律小写；
定名人：命名人的姓一般写在种名之后，英文整体，缩写，首字母大写。的。
二、植物病原原核生物
原核生物(Procaryotes)是指含有原核结构的单细胞生物。
一般是由细胞膜和细胞壁或只有细胞膜包围的单细胞微生物。它的遗传物质(DNA)分散在细胞质中，没有核膜包围，没有明显的细胞核。
2、细菌分类鉴定的依据和方法
（1）经典方法（依据细菌形态、细胞结构、生理生化特性）
a、细胞的形状、大小、结构和染色反应
螺旋不满一圈称为弧菌(vibrio)，满2-6环称为螺旋菌(spirllum)，旋转周数在6环以上的称为螺旋体(spirochaeta)。
细菌结构与染色反应
与细菌鉴定有关的细胞结构：
细胞壁 芽孢 荚膜 鞭毛 内含物
细胞结构的光学鉴定方法：染色 革兰氏染色 芽孢染色法 荚膜染色法 鞭毛染色法
b、 细胞的群体形态（菌落形态、斜面菌苔、液体培养形态）
菌落：微生物单细胞在平板培养基上生长繁殖，形成肉眼能看到的，具有一定形态特征的群体。
菌落特征：大小、形状、隆起形状、边缘和表面状况、颜色、黏度、硬度、透明度等。
细胞的群体形态（菌落形态、斜面菌苔、液体培养形态）
菌苔：在斜面培养基上划线接种，培养3-5天形成的培养物
菌苔特征：
隆起形状、表面形状、表面光泽、质地、颜色等。
c、生理生化反应
常用的细菌鉴定的生化试验
氧化酶
接触酶
葡萄糖氧化
糖发酵
（2）细菌的数值分类法（始于20世纪50年代末 ）
用数理统计的方法处理细菌的各种特征，求出相似值，根据相似值大小决定细菌在分类学中的关系，并进行类群的划分。
数值分类法与传统方法的区别：
采用更多的分类特征，并且各特征不分主次，同等对待。
（3）分子分类法
原 理：
（1）同种细菌DNA中的碱基对的顺序、数量和比例稳定。
（2）不同细菌G+C百分比值的变化幅度较大（27-75%）
b、核酸杂交基本原理：
双链DNA加热解链成为单链；恢复温度后DNA单链互补形成稳定的双链
c、16S rRNA碱基测序（80%的rRNA）
原 理：根据不同原核生物16S rRNA碱基序列的相似性比较不同生物间的进化关系
生物的五界系统：动物界、植物界、原生生物界、真菌界、原核生物界
三原界（三域）系统：沃斯，1978 根据生物的16SrRNA碱基序列，对生物进行划分。真细菌、古细菌、真核生物
（2）细菌的分类系统
影响较大的两部著作：
a、《伯杰氏细菌鉴定手册》，1994年，第九版
特点：以细菌形态、生理类型为依据，参考了系统发育关系b、《伯杰氏系统细菌学手册》，第2版出版中
特点：吸纳了与核糖体RNA测序有关概念，并结合常规分类信息
（二）放线菌
介于细菌与丝状真菌之间而又接近于细菌的一类多核单细胞的丝状原核生物
（2）放线菌的菌落特征
①菌落相对于其它细菌来说较小
②菌落质地致密，表面光平或有皱折
③放大镜下可见菌落外围具辐射状菌丝
（4） 放线菌的繁殖方式
三、植物病毒和类病毒
国际病毒分类委员会 ICTV
(International Committee on Taxonomy of viruses)
1、分类依据
①核酸类型(DNA或RNA)；②核酸是单链或双链；③是否存在脂蛋白包膜；④形态；⑤核酸分段状况等。
2、病毒类似物
①卫星 要依赖其它病毒才能存在的小病毒或核酸。
被依赖的病毒称为辅助病毒(heIper virus)。
②类病毒(viroid) 无衣壳蛋白的核酸侵染因子。
马铃薯纺锤块茎病(PSTVd) Spindle tuber
③朊病毒(prion) 没有核酸只有蛋白质的侵染因子。
3、命名
寄主英文俗名＋症状＋virus
（5）血清学鉴定
血清学技术——就是根据抗原与抗体的特异性结合来鉴定（病毒）。
抗原——一切能够在动物有机体内诱致抗体的物质，称为抗原物质，简称为抗原。
抗血清——带有抗体的血清。
酶联免疫吸附ELISA
原理：利用了酶的放大作用，使免疫检测的灵敏度大大提高。
ELISA的优点：
（1）灵敏度高：检测浓度可达1—10ng/ml
（2）快速：几小时内出结果。
（3）专化性强，重复性好。
（4）检测对象广：粗提液、提纯液均可。完整的和降解的粒体均可。不受抗原形态限制。
（5）适用于处理大批样品。
（6）所用仪器简单，试剂价格低，且可长期保存。具有自动化试剂盒的潜力。
所以说ELISA是实现“快速、准确、经济”检测病毒的最好手段。
线虫的分离
（1）植物材料中线虫的分离
直接观察分离法；
漏斗分离法；
培育分离法；
组织捣碎分离法
（2）土样中线虫的分离
五种方法。
